Introduction
L’arôme des boissons fermentées est d’une composition extrêmement complexe. Les analyses des composés volatils effectuées à ce jour révèlent la présence de plusieurs centaines de substances (Schreirer, 1979 ; Bayonove et al., 1998 ; Rapp, 1998). En effet, plus de 800 composés aromatiques présents dans le raisin ont été séparés par chromatographie en phase gazeuse. Il s’agit essentiellement d’alcools supérieurs, d’esters, d’aldehydes, d’ethers oxydes et de monoterpenes (Fleet et Heard, 1993 ; Ribéreau-Gayon et al., 1998). Ces substances ont pour origine les voies de biosynthèse spécifique, d’une part du cépage (composante variétale) et d’autre part, de micro-organismes réalisant les fermentations (composante fermentaire), mais aussi des réactions chimiques qui se produisent au cours de la conservation (Ebeler, 2001 ; Hernandez-Orte et al., 2005(a)).
Par conséquent, la maîtrise des variables opératoires de la fermentation alcoolique (température, pH, ..) et le bon développement de la microflore levurienne sont nécessaires pour assurer l’épuisement des sucres présents dans le milieu et la production d’arômes fermentaires.
Dans cette optique, la température de fermentation ainsi que la souche de levure jouent un rôle capital (Lambrechts et Pretorius, 2000 ; Brandolini, 2002). La température de fermentation conditionne largement les qualités organoleptiques du produit fini, par le biais de la vitesse de fermentation mais aussi par son effet sur les voies métaboliques de la levure (Nurgel et al., 2003 ; Hernandez-Orte et Ibarz, 2005(b)).Le rôle de la souche de levure a suscité un grand intérêt et a fait l’objet de plusieurs études (Bertrand, 1978 ; Souffleros et Bertrand, 1980 ; Longo et al., 1992 ; Valero et al., 2002 ; Romano et al., 2003)
Cependant les travaux consacrés à ces deux thèmes ont donné des résultats contreversés. Alors que certaines investigations affirment que la conduite de fementations alcooliques à température élevée conduit à des concentrations élevées en alcools supérieurs (Killian et Ough, 1979 ; Nykanen, 1986). D’autres auteurs soutiennent que la synthèse des composés aromatiques est plus importante à basse température (Santamaria et al., 1995 ; Ribéreau-Gayon et al., 2000 ; Torrija et al., 2003 ; Sarkan Sell et al., 2006). De plus, tous ces travaux ne se sont intéressés qu’à la composition finale du milieu fermenté en composés volatils.
Notre présent travail a porté sur l’étude de l’incidence de chacun de ces deux facteurs (température de fermentation et souche de levures) sur les principaux paramètres fermentaires (biomasse, substrat et éthanol) ainsi que sur les cinétiques de production de composés aromatiques synthétisés lors de la fermentation d’un milieu modèle. Ce milieu permet de s’affranchir des variations de moûts de raisin et garantit une meilleure reproductibilité (Strehaiano, 1984).

Matériel et méthodes
Matériel biologique :
Les levures utilisées pour cette étude sont Saccharomyces cerevisiae souches VL1 et QA23 commercialisées par « Laffort œnologie, France » sous forme de levures sèches actives. Le levain est préparé à partir de ces levures conservées dans des tubes gélosés à 4 °C.
Le milieu de fermentation est inoculé par un levain âgé de 12 heures incubé au préalable sur 100 ml de milieu.
Milieu de fermentation :
Les précultures et les fermentations ont été réalisées sur un milieu synthétique modèle proposé par STREHAIANO (1984). La composition en g/l est la suivante : glucose, 70 pour les précultures et 200 pour les fermentations, KH2PO4, 5 ; (NH4)2SO4,2 ; MgSO4(H2O),2 ; extrait de levure (Biomérieux, France),1.
Le pH est ajusté à 3.8 avec une solution de H3PO4 avant l’autoclavage.
Conditions de fermentation :
Les fermentations sont menées dans des réacteurs batch « Setric » d’une capacité de 2.O litres. Le volume du milieu de fermentation étant de 1.6 litre et l’agitation de 200 rpm.
Le taux d’inoculum est de 3. 106 cellules /ml pris d’une préculture âgée de 15 heures.
Des échantillons de 10 ml sont régulièrement prélevés pour la détermination des cinétiques de fermentation.
Plusieurs fermentations sont réalisées, deux températures de fermentations pratiquées en vinification (18 et 30°C) sont examinées et deux souches de levures Saccharomyces Cerevisiae (VL1 et QA23) sont considérées.
Pour toutes les conditions de fermentation étudiées, nous avons établi les cinétiques de croissance, de production d’éthanol et de production des arômes considérés.

Méthodes analytiques :
La quantité de biomasse est déterminée par mesure de la densité optique à 620 nm, dans des cuves de 2 mm de trajet optique, à l’aide d’un spectrophotomètre UV-visible double faisceau Hitachi-2000. La viabilité est estimée par comptage sur cellule de Thoma au microscope, après coloration au bleu de méthylène (Bonara et Mares, 1982).
Le glucose est dosé par une méthode enzymatique grâce à un appareil automatique (Yellow Spring Instruments, modèle 2700 select) renfermant une glucose oxydase. L’éthanol est dosé par chromatographie en phase gazeuse avec un chromatographe chrompack 437 A muni d’un détecteur à ionisation de flamme et avec une colonne Chrompack Poroplot Q wide-bore (0.53 mm x 25 m)
Les arômes fermentaires volatils sont analysés par chromatographie en phase gazeuse-Head space avec un chromatographe 8500 Perkin Elmer (colonne BP 20 polaire (25m x 0.32mm x 0.5 µm)). La température du catharomètre est de 280°D et celle de l’injecteur de 260°C. Le gaz vecteur utilisé est de l’azote à une pression de 25 Psig.
Le dosage des composés aromatiques se fait par l’intermédiaire d’une solution étalon constituée des arômes susceptibles d’être présents dans l’échantillon. Un coefficient de réponse est établit pour 100 mg/l de chaque composé. Chaque échantillon est préchauffé à 60 °C pendant 1 heure avant d’être injecté dans la colonne (temps de préssuration : 0.51 mn, temps d’injection : 0.4. mn).
Nous avons dosé trois alcools supérieurs (n-propanol, isobutanol, alcools amyliques), deux esters (acétate d’éthyle et acétate d’isoamyle) et l’acétaldéhyde car ces composés sont des marqueurs des arômes de la fermentation alcoolique et représentent plus de la moitié des aromes fermentaires volatils (Bertrand, 1978).

Résultats et Discussions :
Influence de la température :
Dans les deux cas, nous observons un découplage partiel de la croissance et de la production d’éthanol mesurée : la production continue après l’arrêt de la croissance (figure 1).
Le cycle fermentaire comprend une phase courte où la croissance s’accélère tandis que la production n’a pas commencé encore, une phase de pleine activité de croissance et de production et enfin une phase où la croissance ralentit puis cesse alors que la production se poursuit : c’est la phase stationnaire. Au cours de cette dernière phase, la biomasse reste viable à près de 100%.
Les cinétiques établies pour chacune des fermentations réalisées, montrent que le substrat est entièrement consommé en des temps respectifs de 167 et 71 heures pour une biomasse produite équivalente (respectivement 5.57 et 5.5 g /l). Ces variations n’indiquent pas une accentuation des phénomènes d’inhibition ou une plus grande sensibilité de la souche de levure VL1 à une température élevée, ce qui est en accord avec les travaux de Saez (1986). La production finale en éthanol obtenue est identique aux deux températures de fermentation considérées (94 g/l).
Pour les six composés aromatiques volatils que nous avons étudiés, nous avons établi les cinétiques de production. Au vu de ces dernières, il apparaît que la synthèse des arômes étudiés dépend fortement de la température de fermentation mais de façon très spécifique selon l’arôme considéré. On peut de prime à bord différencier trois groupes d’arômes selon leur nature et selon que leur production soit liée à la biomasse ou au substrat.
Ainsi, l’acétaldéhyde forme à lui seul le premier groupe, l’acétate d’éthyle et l’acétate d’isoamyle le deuxième groupe et les alcools amyliques, l’isobutanol et le propanol constituent le troisième groupe.
Pour l’acétaldéhyde, son évolution au cours des différentes fermentations présente conformément à la littérature deux phases (Mesias et al., 1983). La première se caractérise par une augmentation rapide de la concentration en acétaldéhyde qui est d’autant plus importante que la température est élevée (5,8 mg/l à 18°C et 9,9 mg/l à 30°C).Cette première phase se termine par une diminution de la concentration en acétaldéhyde dans des proportions identiques à son augmentation.
La deuxième phase, correspondant à la phase stationnaire de croissance, est également constituée d’une augmentation suivie d’une diminution mais cette dernière est plus importante à 18°C (figure2). C’est l’isoenzyme acétaldéhyde déshydrogénase I qui pendant les premières heures de la fermentation réduit l’acétaldéhyde en éthanol avant de diminuer rapidement en activité ; dans la deuxième phase l’isoenzyme acétaldéhyde déshydrogénase II devient plus active et poursuit la réduction de l’acétaldéhyde (Millan et Maurico, 1990).
Selon Romano (1994), ces deux isoenzymes seraient inhibées par l’augmentation de la température au détriment de leur équilibre avec l’enzyme aldéhyde déshydrogénase, provoquant ainsi l’accumulation de l’acétaldéhyde. Cette hypothèse n’est pas en accord avec nos résultats car en terme de concentration finale, la production en acétaldéhyde ne semble pas sensible à la température de fermentation.
En ce qui concerne l’acétate d’éthyle et l’acétate d’isoamyle, la température semble influencer leur production de la même manière. En effet, lorsque la température de fermentation augmente, ces deux esters voient leur production augmenter respectivement d’un gain de 50% et d’un facteur de 7 (figure 3 et 4). Ce comportement est en contradiction avec celui observé dans la littérature (Souffleros et Bertrand, 1980) ; (Ribéreau-Gayon et al., 1998) qui décrit une élévation de teneur en acétate d’éthyle quand la température baisse de 30°Cà 20°C ce qui est probablement due à l’effet souche.
Du point de vue cinétique, les figures 3 et 4 montrent que la plus grande concentration en esters est atteinte pendant la phase de croissance microbienne, puis la synthèse continue à faible vitesse jusqu’à épuisement des sucres.
Pour les alcools supérieurs, la formation du propanol-1 ne semble pas influencée par l’élévation de la température de 18 à 30°C. Nous obtenons une concentration finale de 1,7 mg/l pour les deux températures étudiées (figure 5).
Le propanol-1 est produit par la levure tout au long de la fermentation suivant la corrélation suivante :
Y= - 0.075 S + 1.72 à 18°C r2 = 0.98 (Y : conc. en propanol en mg/l
(S : conc . sucres en g/l)
Y= - 0.074 S + 2.01 à 30°C r2 = 0.98
L’isobutanol diminue de moitié quand la température de fermentation passe de 30 à 18°C et la figure 6 montre qu’à priori, sa formation est liée à la croissance de la biomasse : elle a tendance à augmenter rapidement pour atteindre un plateau à la fin de la phase exponentielle de croissance.
L’évolution des alcools amyliques est, sous l’effet de la température, similaire à celle de l’isobutanol (figure 7). Leur synthèse baisse de plus de 23% en passant de 30 à 18°C et est liée à la biomasse produite comme le démontrent ces corrélations :
Y= 81.08 X-9.35 à 18°C r2 = 0.99 (Y : conc. en alcools amyliques en mg/l
( X : conc. biomasse levurienne en g/l)
Y= 97.32 X- 7.11 à 30°C r2 = 0.98
Dans notre cas, il semblerait que la voie catabolique liée à l’assimilation des acides aminés soit prépondérante dans la formation des alcools supérieurs ( Valero et al., 2002 ; Hernandez-Orte, 2005 (a)).

Influence de la souche de levure :
Après avoir observé l’effet de la température de fermentation sur les paramètres fermentaires et les cinétiques de production des composés aromatiques, nous avons pensé intéressant de voir si l’utilisation d’une autre souche œnologique pouvait conduire à des cinétiques de production sensiblement différentes dans les mêmes conditions. Nous avons donc réalisé des fermentations sur le même milieu et à une température de 30°C avec la souche Saccharomyces cerevisiae QA23 également connue pour son potentiel aromatique.
Le tableau I regroupant les principaux paramètres fermentaires de la souche QA23 en comparaisant avec ceux de la souche VL1, montre que les deux souches présentent les mêmes performances fermentaires. En effet, la souche QA23 consomme tout le substrat sur une période de 65 heures et produit 5.65 g/l de biomasse ainsi que 95.2 g/l d’éthanol.
L’allure des cinétiques de production d’acétaldéhyde par les deux souches de levure VL1 et QA23 est similaire avec une concentration en fin de fermentation respectivement de 6.5 mg/l et 5.15 mg/l (figure 8 ).
L’acétate d’éthyle, qui d’après la bibliographie est l’ester le plus abondant formé par la levure (Ribereau-Gayon et al., 1998), est produit par QA 23 en une concentration supérieure à celle enregistrée par la souche VL1. Il semblerait que la souche QA23 possède un pouvoir œstrogène supérieur à celui de la souche VL1 car elle produit également un peu plus d’acétate d’isoamyle (figure 9et 10).
A l’inverse des esters, les alcools supérieurs : propanol-1, isobutanol et alcools amyliques, sont produits en quantité moindre par la souche QA23 par rapport à VL1 : soit 13.3% de moins pour le propanol-1, 12.7 % pour l’isobutanol et 13.1% pour les alcools amyliques.

Conclusion et recommandations :

L’objectif du présent travail consistait à mettre en évidence l’influence de la température ainsi que celle de la souche de levure sur les paramètres fermentaires et sur les cinétiques de production des composés aromatiques considérés. D’après les résultats obtenus, nous pouvons dire que le facteur température a un effet considérable sur la synthèse des aromes volatils. En terme de concentration, nous notons une nette baisse de la production totale d’arômes en passant de 30 à 18°C : il s’agit pour l’essentiel de celle des alcools amyliques et de l’isobutanol.
La synthèse qui d’après les corrélations établies, est étroitement liée à la consommation des sucres, diminue lorsque la température de fermentation baisse. Ce qui ne correspond pas aux observations rapportées par certains auteurs et la contreverse demeure.
L’effet de la température sur la production des composés volatils au cours d’une fermentation alcoolique, reste à notre avis difficilement extrapolable. En effet, il est difficile d’isoler ce paramètre d’autres ayant également un effet notable sur la production de ces métabolites comme le pH, la composition du milieu en acides aminés et la teneur en azote assimilable.
De plus, l’appréciation de l’impact de ce paramètre sur la qualité de la boisson finie reste soumise à un équilibre global prenant en compte d’autres composés. Quant à l’effet souche, en terme de production de composés aromatiques volatils, nous notons une synthèse d’esters supérieure et une production en alcools supérieurs moindre par la souche QA23 par rapport à VL1. Les cinétiques de productions sont tout de même similaires.
L’accentuation de l’effet souche a été dans nos conditions expérimentales, moins importantes qu’avec la température.

REFERENCES

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